Identifizierung der molekularen Subtypen und Erstellung von Risikomodellen beim Neuroblastom

Jul 11, 2023

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 11790 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die Heterogenität des Neuroblastoms wirkt sich direkt auf die Prognose der Patienten aus. Die Individualisierung der Patientenbehandlung zur Verbesserung der Prognose stellt in diesem Stadium eine klinische Herausforderung dar und das Ziel dieser Studie ist die Charakterisierung verschiedener Patientengruppen. Um dies zu erreichen, wurden immunbezogene Zellzyklusgene, die im GSE45547-Datensatz mithilfe von WGCNA identifiziert wurden, verwendet, um Fälle aus mehreren Datensätzen (GSE45547, GSE49710, GSE73517, GES120559, E-MTAB-8248 und TARGET) durch Konsens-Clustering in Untergruppen zu klassifizieren . Zur Beurteilung des Immunstatus der Patienten wurden SCHÄTZUNGEN, CIBERSORT und ssGSEA verwendet. Und ein 7-Gen-Risikomodell wurde basierend auf unterschiedlich exprimierten Genen zwischen Subtypen unter Verwendung von randomForestSRC und LASSO erstellt. Die Anreicherungsanalyse wurde verwendet, um die biologischen Eigenschaften zwischen verschiedenen Gruppen zu zeigen. Schlüsselgene wurden mithilfe von randomForest gescreent, um ein neuronales Netzwerk aufzubauen, und validiert. Schließlich wurde die Arzneimittelsensitivität in den GSCA- und CellMiner-Datenbanken bewertet. Wir klassifizierten die 1811 Patienten basierend auf immunbezogenen Zellzyklusgenen in zwei Subtypen. Die beiden Subtypen (Cluster1 und Cluster2) zeigten unterschiedliche klinische Merkmale, Immunniveaus, chromosomale Instabilität und Prognose. Die gleichen signifikanten Unterschiede wurden zwischen der Hochrisikogruppe und der Niedrigrisikogruppe nachgewiesen. Durch unsere Analyse haben wir Neuroblastom-Subtypen mit einzigartigen Merkmalen identifiziert und Risikomodelle etabliert, die unser Verständnis der Neuroblastom-Heterogenität verbessern werden.

Das Neuroblastom, ein Tumor sympathischen Ursprungs, ist der häufigste extrakranielle solide Tumor im frühen Kindesalter. Neuroblastome machen 7–8 % der bösartigen Erkrankungen im Kindesalter aus und weisen einen heterogenen klinischen Verlauf auf, der von lokaler oder spontaner Regression bis hin zu ausgedehnten Metastasen reicht1. Die Ätiologie der Krankheit ist komplex und vielfältig und umfasst mehrere Signalwege. Das Säugetierziel des Rapamycin-Signalwegs (mTOR) fördert das Überleben von Neuroblastomzellen und die Chemoresistenz2. Der WNT-Signalweg hingegen erhöht die MYC-Spiegel bei Patienten ohne MYCN-Amplifikation3. Darüber hinaus ist der ALK-Signalweg der primäre Onkogen-Zielweg bei sporadischen und familiären Neuroblastomfällen4.

Wie wir alle wissen, ist die uneingeschränkte Proliferation ein häufiges Merkmal bösartiger Tumoren und steht in engem Zusammenhang mit der Dysregulation des Zellzyklus5. Der Zellzyklus ist ein komplexer Prozess, der vier Phasen umfasst: Lücke 1 (G1), DNA-Synthese (S), Lücke 2 (G2) und Mitose (M). Zellzyklusproteine ​​und Zellzyklusprotein-abhängige Kinasen (CDK) regulieren den Verlauf der Zellzyklusphasen6. Ob jedes Zellzyklusereignis korrekt abgeschlossen wird oder nicht, unterliegt gleichzeitig einem zellulären Kontrollpunkt-Überwachungsmechanismus7. Die DNA-Schadensreaktion und der Mitotic Spindle Checkpoint spielen eine Schlüsselrolle bei der Erhaltung der Gesundheit des Organismus. Wie bekannt ist, ist der p53-Tumorsuppressor an mehreren Kontrollpunkten des Zellzyklus beteiligt8. Und Anomalien in p53 können über mehrere Wege zur Krebsentstehung und -progression führen9.

Auch Abnormalitäten in Zellzyklus-bezogenen Mechanismen spielen eine wichtige Rolle bei der Entstehung und Entwicklung von Neuroblastomen. Bei 25 % der Patienten mit Neuroblastomen wurde eine erhöhte MYCN-Kopienzahl festgestellt10, was stark mit einer ungünstigen klinischen Prognose verbunden war11. Unterdessen kann MYCN die Zellproliferation beschleunigen12, was möglicherweise mit der Zellzyklus-Protein-abhängigen Kinase 4 (CDK4)13 zusammenhängt. Bei Patienten mit einem Neuroblastom ohne MYCN-Amplifikation ist es wahrscheinlicher, dass es chromosomale Veränderungen aufweist, was wiederum zu schlechten prognostischen Ergebnissen führt14. Dies hängt möglicherweise mit dem Fehlen einer gemeinsamen Region zusammen, die eine Reihe von Proteinen kodiert, die bei der DNA-Schadensreaktion (DDR) eine Rolle spielen15. Da die Forschung immer tiefer geht, spielt die Chromosomeninstabilität eine wichtige Rolle bei der Entwicklung und dem Fortschreiten der Krankheit16. Die Studie ergab, dass ein unausgeglichener Verlust der Heterozygotie (LOH) in Chromosom 11q und LOH in Chromosom 1p36 unabhängige Risikofaktoren für eine schlechte Prognose bei Patienten mit Neuroblastomen sind17. Der 17q-Gewinn war auch mit einem schlechteren Gesamtüberleben (OS) verbunden14. Chromosomeninstabilität wurde auch während der frühen menschlichen Embryogenese beobachtet18. Der zugrunde liegende Mechanismus sorgt jedoch dafür, dass der Zellzyklus korrekt abläuft. Daher ist das Verständnis der am Zellzyklus beteiligten Mechanismen von entscheidender Bedeutung für unser Verständnis des Neuroblastoms.

Verschiedene Ätiologien führen zu Schwankungen zwischen einzelnen Patienten. Die Heterogenität der Patienten stellt eine große Herausforderung für eine individualisierte Behandlung dar. Um Patienten im Hinblick auf eine Stratifizierung als Leitfaden für die Behandlung zu bewerten, wurden Klassifizierungsmethoden basierend auf mehreren biologischen Indikatoren vorgeschlagen und angewendet. Stadium, Alter, histologische Kategorie, Grad der Tumordifferenzierung, Status des MYCN-Onkogens, Chromosom-11q-Status und DNA-Ploidie wurden als Klassifizierungsgrundlage für das International Neuroblastoma Risk Group Staging System19 verwendet. Segmentale Chromosomenaberrationen (SCA) wurden auch als zusätzlicher genomischer Biomarker in Kombination mit dem INSS-Stadieneinteilung als Leitfaden für die Behandlung untersucht20. Basierend auf dem Konzept der stratifizierten Behandlung verbessert sich die Prognose von Neuroblastompatienten schrittweise. In den letzten Jahrzehnten ist die 5-Jahres-Überlebensrate für Patienten mit metastasiertem Neuroblastom durch eine Kombination von Therapien wie Immuntherapie, Stammzelltherapie usw. von weniger als 20 % auf über 50 % gestiegen21. Obwohl diese Stadieneinteilung eine Rolle bei der Beurteilung von Patienten und der Steuerung der Behandlung spielt, ist der klinische Nutzen etwas eingeschränkt. Mit der Entwicklung der Gen-Chip-Technologie ist die Frage, wie Patienten auf genetischer Ebene geschichtet werden können, um eine gezielte Therapie zu steuern, eine dringende Frage.

Angesichts der Rolle von Zellzyklusanomalien bei der Pathogenese von Neuroblastomen ist es wichtig, die Ursachen der chromosomalen Instabilität (CIN) bei Neuroblastomen zu verstehen und die Chromosomen- und Zentrosomensegregation, die Spindelmaschinerie und die DNA-Reparatur zu untersuchen1. Dies erleichtert die Erforschung einer individuellen Behandlung von Neuroblastompatienten mit Medikamenten, die auf den Zellzyklus abzielen. Ziel unserer Studie ist es, die molekulare Subtypisierung bei Tumorpatienten durch die Analyse der Genexpressionsniveaus im Zellzyklus zu untersuchen, um das individualisierte Patientenstratifizierungsmanagement weiter zu verfeinern. Molekulare Subtypisierung und Risikoscores werden verwendet, um eine individuelle Patientenbehandlung zu steuern und so die Patientenprognose zu verbessern.

Zunächst klassifizierte der t-SNE-Algorithmus die 643 Patienten in GSE45547 anhand der Genexpressionsniveaus in verschiedene Regionen, was auf Heterogenität zwischen den Patienten hinweist. Dieses Ergebnis legt nahe, dass die Krankheit weiter in molekulare Subtypen unterteilt werden kann (Abb. 1A). Unter Berücksichtigung der engen Korrelation der Krankheit mit dem Zellzyklus und der Immunität wurde der Algorithmus ESTIMATE basierend auf transkriptomischen Daten von 643 Proben angewendet, um den Grad der Infiltration von Immun- und Stromazellen zu beurteilen, die an der Tumormikroumgebung (TME) von GSE45547 beteiligt sind. Die Ergebnisse wurden auch als klinische Informationen bei der Suche nach immunbezogenen Zellzyklusgenen in den WGCNA-Algorithmus integriert (ergänzende Abbildung S1A). Anschließend wurde das schuppenfreie Koexpressionsnetzwerk durch WGCNA von 1740 Zellzyklus-Genexpressionen aus 643 Proben mit Immunisierungsergebnissen erhalten (Abb. 1B). Es wurden zwei Genmodule mit einer Potenz von 4 als optimaler weicher Schwelle generiert (Abb. 1C). Unter diesen Modulen wies das türkisfarbene Modul die höchste Korrelation mit dem Ergebnis von ESTIMATE auf und wurde als „Modul für immunbezogene Zellzyklusgene (IRCCGs)“ betrachtet. Und es gab 924 Gene im türkisfarbenen Modul (eine detaillierte Liste der Gene finden Sie im Zusatzmaterial). Wir haben die Funktion von IRCCGs durch Anreicherungsanalyse weiter untersucht. Die KEGG-Anreicherungsergebnisse für IRCCGs zeigten Zusammenhänge sowohl mit Immun- als auch Zellzyklus-bezogenen Signalwegen (Abb. 1D). Die mit Biological Process angereicherten Ergebnisse zeigten, dass die Regulierung des Zellzyklus und die Kernteilung beteiligt waren (Abb. 1E). Die Genprodukte von IRCCGs spielen eine Rolle in der Spindel- und Chromosomenregion (Abb. 1F). Die Ergebnisse der Anreicherung molekularer Funktionen zeigten, dass Pfade wie die Bindung von Tubulin und die Bindung von Mikrotubuli beteiligt sind (Abb. 1G).

Identifizierung und Funktionsanalyse von IRCCGs. (A) Die Ergebnisse des t-SNE-Algorithmus zeigen Heterogenität bei den Patienten. (B) Analyse der Netzwerktopologie für verschiedene Soft-Thresholding-Leistungen. Das linke Feld zeigt den skalenfreien Anpassungsindex als Funktion der Soft-Thresholding-Leistung. Das rechte Feld zeigt die mittlere Konnektivität als Funktion der Soft-Thresholding-Leistung an. Basierend auf dem skalenfreien Anpassungsindex von mehr als 0,9 haben wir 4 als weiche Schwellenwertstärke gewählt. (C) Oben ist ein Cluster-Dendrogramm von Genen mit zugewiesenen Modulfarben zu sehen. Unten finden Sie Modul-Merkmals-Zuordnungen. Jede Zelle enthält die entsprechende Korrelation und den P-Wert. Je dunkler die Farbe der Zelle ist, desto höher ist die Korrelation. (D) Ergebnisse der KEGG-Anreicherung. Die Zahlen in der Grafik geben die Anzahl der Pfade an. (E) Ergebnisse der biologischen Prozessanreicherung. Die Linie zwischen den Punkten zeigte das Vorhandensein identischer Gene zwischen den Signalwegen an. (F) Die fünf wichtigsten Wege der Anreicherung zellulärer Komponenten wurden demonstriert. Die Länge des gelben Balkens zeigte die Anzahl der Pathway-Gene an. Die Höhe des blauen Balkens zeigte die Anzahl der sich überschneidenden Gene an. (G) Die ersten 5 angereichert um molekulare Funktionsbegriffe und die Gene in den Begriffen. (H,I) Hauptkomponentenanalyse (PCA) der Genexpression in Datensätzen. Die Visualisierung der Patienten durch Streudiagramme basierte auf den beiden obersten Dims der Genexpressionsprofile unter Entfernung des Batch-Effekts.

Um die Ergebnisse der Studie objektiver und verallgemeinerbarer zu machen, wurden die Daten GSE45547, GSE49710, GSE73517, GSE120559, E-MTAB-8248 und GDC TARGET-NBL zur Analyse integriert. Insgesamt wurden 16.978 Gene von 1811 Patienten gemeinsam nachgewiesen. Vor der Beseitigung des Chargeneffekts zeigte das Ergebnis der Hauptkomponentenanalyse (PCA), dass die Proben nach Chargen gruppiert waren (ergänzende Abbildung S1B). Im Gegensatz dazu zeigen die Ergebnisse nach der Datenverarbeitung, dass die plattformübergreifende Normalisierung erfolgreich Batch-Effekte eliminieren konnte (Abb. 1H). In den normalisierten Daten betrug die Schnittmenge von 16.978 Genen mit immunbezogenen Zellzyklus-Genen 913 Gene. Insgesamt wurden 11 Gene von 924 IRCCGs nicht in die Folgeanalyse einbezogen. Dies lag daran, dass unterschiedliche Mikroarrays über unterschiedliche Sonden verfügen und die gemeinsamen Gene für die kombinierte Analyse ausgewählt wurden. Da die Microarray-Daten alle von derselben Plattform stammten, wurden die fünf Microarray-Datensätze normalisiert und als Ganzes in die nachfolgende Studie einbezogen (ergänzende Abbildung S1C, Abbildung 1I).

Basierend auf der Expressionsmatrix nach Entfernung des Batch-Effekts von 913 IRCCGs wurden alle 6 Datensätze (n = 1811) durch Konsensus-Clustering (Abb. 2A), eine unbeaufsichtigte Clustering-Methode mit dem k-Wert von 2, in zwei unterschiedliche Zellzyklus-Cluster unterteilt. Ergänzende Abbildung S2A–C). Es gab 871 Patienten in Cluster I und 940 Patienten in Cluster II. Darüber hinaus lag der Cluster-Konsens-Score für jede Untergruppe nur bei der Klassifizierung mit zwei Untergruppen über 0,8 (Abb. 2B), was darauf hindeutet, dass die Klassifizierung mit zwei Untergruppen robuster war als andere.

Identifizierung von Subtypen und klinische Korrelationen von Subtypen. (A) Konsensmatrix-Heatmap mit einer Clusteranzahl von 2. (B) Die Balkendiagramme stellen die Konsenswerte für Untergruppen dar und wir haben die Ergebnisse mit Konsenswerten größer als 0,8 ausgewählt. (C) Heatmap der 50 wichtigsten immunbezogenen Zellzyklus-Gene und Verteilung von Alter, MYCN-Status und INSS-Stadium in den beiden Clustern. (D) Das Sankey-Diagramm, das zeigt, ob es sich bei TERT um eine Neuordnung handelte und ob APB existierte. (E) Das Balkendiagramm zeigte die Verteilung der Chromosomenanomalien in den beiden Clustern. (F) Die Kaplan-Meier-Kurven zeigten die OS-Zeit der beiden Patientengruppen innerhalb der E-MTAB-8248- und TARGET-Datensätze.

Um die Unterschiede zwischen den Clustern zu verstehen, wurden die klinischen Informationen im Datensatz verwendet, um die Merkmale jedes der beiden Cluster zu untersuchen. Die Wärmekarte zeigt die Clusterbildung in Bezug auf Alter, Stadien des International Neuroblastoma Staging System (INSS) und MYCN-Status sowie die Expression der für die Clusterbildung verwendeten Gene bei 1811 Patienten (Abb. 2C). Die in der Heatmap angezeigten Gene waren die Top-50-Gene mit der größten mittleren absoluten Abweichung der Genexpression. Eine weitere statistische Analyse der klinischen Informationen der beiden Cluster ergab, dass das Alter von Cluster 2 kleiner war als das von Cluster 1 (P < 0,05). Die detaillierten statistischen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 1 aufgeführt. Unterdessen war der MYCN-Status der Patienten in Cluster 1 hauptsächlich verstärkt, während der MYCN-Status der Patienten in Cluster 2 hauptsächlich nicht verstärkt war (P < 0,05). Das INSS-Stadium, das eng mit der Prognose zusammenhängt, unterschied sich auch signifikant in Cluster 1 und Cluster 2 (P < 0,05). Die alternative Verlängerung der Telomere (ALT) wird durch bruchinduzierte Replikation reguliert. Ein Sankey-Diagramm zeigt den Fluss von den beiden Zellzyklusclustern zu unterschiedlichen Status von Telomerase-Reverse-Transkriptase (TERT) und ALT-assoziierten Promyelozyten-Leukämiekörpern (APBs) in den Datensätzen E-MTAB-8248 und GSE120559, in denen die Breite der Flussrate angegeben ist ist proportional zur Anzahl der Patienten (Abb. 2D). Beim Status der Telomerase-Reverse-Transkriptase waren TERT-Umlagerungen in Cluster 1 vorherrschender (P < 0,05), während sich die Frage, ob ALT-assoziierte promyelozytische Leukämiekörperchen nachgewiesen wurden oder nicht, in den beiden Clustern nicht direkt unterschied (P > 0,05). Das Balkendiagramm zeigte die drei Chromosomenanomalien, die eng mit der Prognose im GSE73517-Datensatz verbunden sind: 1p-Deletion, 11q-Deletion und 17q-Gewinn (Abb. 2E). Wie in der statistischen Tabelle 1 gezeigt, unterschied sich der jeweilige Anteil der 1p-Deletion und des 17q-Gewinns an der Gesamtzahl der Cluster in den beiden Clustern (P < 0,05). Die Mengen der 11q-Deletion unterschieden sich jedoch nicht zwischen den beiden Clustern (P > 0,05). Anhand der Überlebensdaten von E-MTAB-8248 und GDC TARGET-NBL wurden die Unterschiede in der Prognose zwischen den beiden Clustern verglichen. Die Ergebnisse zeigten, dass der Prognosestatus von Cluster 2 besser war als der von Cluster 1, was mit der Verteilung der klinischen Prognoseindikatoren zwischen den beiden Gruppen übereinstimmte (Abb. 2F).

Die Mikroumgebung des Immunsystems steht in engem Zusammenhang mit Tumoren und die Expression von Immun-Checkpoints ist ein Spiegelbild der Immunantwort. Unter den fünf integrierten Microarray-Datensätzen wurden 24 Immun-Checkpoints für den Vergleich zwischen Clustern ausgewählt. Wie die Ergebnisse zeigen, waren die Werte der Immun-Checkpoints mit Ausnahme von LAG3, CD276 und CD86 in Cluster 2 höher als in Cluster 1 (Abb. 3A). Basierend auf CIBERSORT wurde die Immuninfiltration abgeschätzt und ein Balkendiagramm verwendet, um den Prozentsatz der Immunzellen bei jedem Patienten anzuzeigen (Abb. 3B). Um die Variabilität der Immunisierung zwischen Clustern in GSE45547 zu vergleichen, wurde eine Analyse durchgeführt, um die Unterschiede zwischen den beiden Clustern von Immunzellen entsprechend der Cluster-Gruppierung zu vergleichen. Die Ergebnisse deuten auf eine signifikante Variabilität in den Immunzellen der beiden Cluster hin (Abb. 3C). Eine weitere Quantifizierung von Immunzellen mittels ssGSEA zeigt, dass Cluster 2 insgesamt mehr Immunzellen aufweist als Cluster 1 (Abb. 3D). In den anderen fünf Datensätzen, wiederum unter Verwendung der CIBERSORT-Ergebnisse und der ssGSEA-Ergebnisse im Vergleich zwischen den beiden Clustern, zeigte Cluster 2 alle eine stärkere Immuninfiltration (ergänzende Abbildung S3A – E).

Vergleich der Immunisierung zweier geclusterter Subtypen. (A) Boxplots zeigten die mRNA-Expression von Immun-Checkpoints in zwei Clustern (*P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001). (B) Das gestapelte Balkendiagramm zeigte den Prozentsatz der Immunzellen bei 1811 Patienten. (C) Boxplots wurden verwendet, um die Verteilung der vom CIBERSORT-Algorithmus berechneten Zellanteile von Immunzellen zwischen den beiden Clustern anzuzeigen (*P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001). (D) Boxplot der Verteilung der Immunzellexpression zwischen den beiden Clustern, berechnet durch den ssGSEA-Algorithmus (*P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001). (E–J) Boxplots wurden erstellt, um die Verteilung des Stroma-Scores, des Immun-Scores, des ESTIMATES-Scores und der Tumorreinheit zu visualisieren, die mit dem ESTIMATE-Algorithmus zwischen den beiden Clustern in GSE45547 (E), GSE49710 (F) berechnet wurden. , GSE73517 (G), GSE120559 (H), E-MTAB-828 (I) und TARGET (J) Datensätze.

Der Immunstatus der Patienten wurde innerhalb der sechs Datensätze mithilfe des ESTIMATE-Algorithmus weiter bewertet. Die Analyseergebnisse zeigen im GSE45547-Datensatz eine höhere Tumorreinheit in Cluster 1 als in Cluster 2 (P < 0,05). Relativ dazu waren der Stroma-Score, der Immun-Score und der ESTIMATE-Score in Cluster 1 niedriger als in Cluster 2 (P < 0,05) (Abb. 3E). Die gleiche Analyse wurde für die anderen fünf Datensätze validiert (Abb. 3F – J). Wenn wir die Ergebnisse der vorherigen Analyse kombinieren, glauben wir, dass Cluster 2 zur Klasse mit hohem Immunstatus und Cluster 1 zur Klasse mit schlechtem Immunstatus gehört.

Um die Schlüsselgene, die die Unterschiede zwischen den Clustern verursachen, eingehend zu untersuchen, wurden mithilfe des „DESeq“-Pakets in den TARGET-Daten zwischen den beiden Clustern insgesamt 4945 Differenzgene erhalten, von denen 1022 in Cluster 1 im Vergleich zum Cluster stark exprimierte Gene waren 2 und 3923 waren gering exprimierte Gene (Abb. 4A) (Ergänzende Abb. S4A). Die Varianzanalyse der fünf normalisierten Datensätze mit dem „limma“-Paket ergab 238 Varianzgene. Das Ergebnis enthielt 161 hochregulierte Gene und 77 herunterregulierte Gene (Cluster1 VS Cluster2) (Abb. 4B). Insgesamt 206 sich überschneidende Gene aus den beiden Differenzanalysen wurden als Intergruppen-Differenzgene für die Cluster 1 und 2 bezeichnet (Abb. 4C). Anschließend haben wir mithilfe der STRING-Datenbank ein Protein-Protein-Interaktionsnetzwerk (PPI) aufgebaut (ergänzende Abbildung S4B). Die auf dem MCC-Algorithmus basierenden TOP 30-Gene wurden mithilfe des CytoHubba-Plug-Ins in Cytoscape weiter demonstriert (Abb. 4D).

Identifizierung von DEGs und funktionale Annotation von DEGs. (A) Das Vulkandiagramm stellte die Verteilung der DEGs im TARGET-Datensatz (Cluster1 VS Cluster2) dar und beschriftete die Top-5-Gene mit der kleinsten Rangfolge entsprechend dem angepassten P-Wert. (Gene mit einem angepassten P-Wert > 0,05 wurden im Diagramm nicht angezeigt). (B) Heatmap der DEGs, abgeleitet aus den 5 Microarray-Datensätzen. (C) Das Ven-Diagramm zeigte die Anzahl der sich überschneidenden Gene in den Ergebnissen der Differenzanalyse. (D) Die TOP 30-Gene basierend auf dem MCC-Algorithmus, wobei die dunkleren Farben die höheren MCC-Werte anzeigen. (E,F) Balkendiagramm (E) zeigte die Ergebnisse der GO-Anreicherung und Blasendiagramme (F) zeigten KEGG-Anreicherungsergebnisse für Cluster 1 im Vergleich zu stark exprimierten Genen von Cluster 2. Die Zahlen im Balkendiagramm repräsentierten die Anzahl im Pfad. (G,H) Balkendiagramm (G) zeigte die Ergebnisse der GO-Anreicherung und Blasendiagramme (H) zeigten KEGG-Anreicherungsergebnisse für Cluster 1 im Vergleich zu niedrig exprimierten Genen von Cluster 2. Die Zahlen im Balkendiagramm repräsentierten die Anzahl im Pfad. In den GO-Anreicherungsergebnissen (E,G) bezieht sich BP auf den biologischen Prozess, CC bezeichnet die zelluläre Komponente und MF steht für die molekulare Funktion.

Um Einblick in die Funktion der Differenzgene zu gewinnen, wurde eine Anreicherungsanalyse durchgeführt. Für die stark exprimierten Gene (Cluster1 VS Cluster2) zwischen den beiden Clustern zeigten die GO-Anreicherungsergebnisse, dass diese Gene eng mit dem Fortschreiten des Zellzyklus verbunden waren (Abb. 4E). Die TOP 5-Begriffe im Bereich Biologische Prozesse waren Chromosomensegregation, mitotische Kernteilung, Kernteilung, Organellenspaltung und Schwesterchromatidsegregation. Die Ergebnisse der Zellkomponente betrafen hauptsächlich die Chromosomenregion; Chromosom, zentromere Region; kondensiertes Chromosom; kondensiertes Chromosom, zentromere Region und Spindel. Mikrotubuli-Bindung; Tubulinbindung; motorische Aktivität der Mikrotubuli; Katalytische Aktivität (wirkt auf DNA) und motorische Aktivität des Zytoskeletts waren die TOP 5-Begriffe in Molecular Function. Die KEGG-Analyse legte nahe, dass stark exprimierte Gene (Cluster1 vs. Cluster2) hauptsächlich mit dem Zellzyklus, der DNA-Replikation, der Oozytenmeiose und anderen eng mit dem Zellzyklus verbundenen Signalwegen verbunden waren (Abb. 4F).

Die Anreicherungsergebnisse für niedrig exprimierte Gene zeigten einen Zusammenhang mit der Immunität. Die Ergebnisse der GO-Anreicherung umfassen hauptsächlich die Antigenverarbeitung und Präsentation von exogenem Peptidantigen über die Bindung von MHC-Klasse-II- und MHC-Klasse-II-Proteinkomplexen (Abb. 4G). Ebenso standen die Ergebnisse der KEGG-Anreicherung in engem Zusammenhang mit der Immunität (Abb. 4H). Generell zeigten die Anreicherungsanalysen, dass DEGs nicht nur eine wichtige Rolle bei der Chromosomenteilung spielen, sondern auch mit der Reparatur von DNA und der Immunität verbunden sind. Gleichzeitig entsprachen die Anreicherungsergebnisse der beiden Gruppen-DEGs den Ergebnissen der vorherigen klinischen und immunologischen Analysen.

Basierend auf den Anreicherungsergebnissen, die darauf hindeuten, dass DEGs stark mit chromosomaler Instabilität und Krankheitsheterogenität bei Patienten assoziiert sind, haben wir beschlossen, nach Schlüsselgenen innerhalb von DEGs zu suchen, um ein Risikomodell zu erstellen. Zunächst haben wir durch eine univariate Cox-Regressionsanalyse im E-MTAB-8248-Datensatz (Ergänzungstabelle 1) vorab 177 OS-bezogene Gene mit einem Filterschwellenwert von P-Wert unter 0,01 herausgesucht und ihre 10 wichtigsten Gene anhand einer Waldkarte angezeigt (Abb . 5A). Im nächsten Schritt wurde das Paket „randomForestSRC“ verwendet, um die Schlüsselvariablen zu filtern. Wie in Abb. 5B gezeigt, stabilisiert sich die OOB-Fehlerrate tendenziell, wenn der Baum > 200 ist, während die Wichtigkeit der Variablen mithilfe des VIMP-Algorithmus (Variable Importance) beurteilt wurde und die längeren blauen Balken die wichtigeren Variablen anzeigen (Abb. 5B). . Wir haben die 50 wichtigsten Gene basierend auf dem VIMP für die Aufnahme in das LASSO Cox-Regressionsmodell ausgewählt (ergänzende Abbildung S5A). Mit einem optimalen λ-Wert (Abb. 5C, D) behielten 7 Gene (NMU, E2F3, UBE2S, DHFR, MIA, CHD5 und FAXDC2) ihre individuellen Cox-Koeffizienten nach der LASSO-Regularisierung (Ergänzungstabelle 2). Unter Verwendung der festgelegten Formel wurde der Risikoscore für jede Probe berechnet (Abb. 5E). Mit einem besten Grenzwert (ergänzende Abbildung S5B) wurde der Datensatz in Gruppen mit niedrigem Risiko und hohem Risiko unterteilt (Abb. 5F). Die Kaplan-Meier-Analyse zeigte, dass Patienten mit einem höheren Risikoscore im E-MTAB-8248-Datensatz ein schlechteres progressionsfreies Überleben (PFS) und ein schlechteres OS aufwiesen (Abb. 5G, H).

Konstruktion des Risikomodells. (A) Das Walddiagramm zeigte die HR und das 95 %-Konfidenzintervall der wichtigsten TOP-10-Gene in den Ergebnissen der univariaten Regression, sortiert nach P-Wert. (B) Das linke Diagramm zeigt die Variation der Fehlerrate mit der Anzahl der Bäume. Die rechte Grafik zeigt die Rangfolge der Gene entsprechend der Wichtigkeit des VIMP-Algorithmus, wobei Blau für günstig für die korrekte Beurteilung der Endungen und Rot für ungünstig steht. (C) Jede Linie im obigen Diagramm stellte ein Gen dar, die vertikale Koordinate war der Wert des Koeffizienten, die untere horizontale Koordinate war log(λ) und die obere horizontale Koordinate war die Anzahl der Koeffizienten ungleich Null im Modell bei diesmal. (D) Basierend auf der Kreuzvalidierung können wir für jeden Wert von λ um den Mittelwert der rot dargestellten Zielkovariate ein Konfidenzintervall für die Zielkovariate erhalten. Die beiden gestrichelten Linien geben jeweils die beiden besonderen λ-Werte an. Als letzten Modellparameter haben wir lambda.1se gewählt. (E) Jeder Punkt im Streudiagramm stellte den Überlebensstatus und die Überlebenszeit eines Patienten dar. Die horizontalen Koordinaten waren die Patienten, die entsprechend ihrer Risikobewertung vom niedrigsten zum höchsten eingestuft wurden. (F) Basierend auf der Risikobewertung jedes Punkts im Streudiagramm, der einen Patienten repräsentiert, haben wir sie in Hochrisiko- und Niedrigrisikogruppen eingeteilt. (G,H) Die Kaplan-Meier-Kurven zeigten die progressionsfreie Überlebenszeit (G) und OS-Zeit (H) der beiden Risikogruppen von Patienten im E-MTAB-8248-Datensatz.

Zunächst wurden die ROC-Kurven (Receiver Operating Characteristic) klinischer Indikatoren im Zusammenhang mit der Prognose im E-MTAB-8248-Datensatz verglichen, und die Risikobewertungen waren alle besser als diese Indikatoren (Abb. 6A). Darüber hinaus zeigte die ROC-Kurvenanalyse, dass die Werte der Fläche unter der Kurve (AUC) der OS-Signatur in 1, 3 und 5 Jahren 0,9527, 0,87266 und 0,8792 betrugen, was darauf hinweist, dass unsere Prognosesignaturen eine günstige Unterscheidung aufweisen (Abb. 6B). Unterdessen korrelierten die Risikoscores im GDC TARGT-NBL-Datensatz auch stark mit dem OS (Abb. 6C). Darüber hinaus analysierten und kartierten wir die Expressionsprofile von sieben Genen in verschiedenen Risikountergruppen von 1670 Patienten, und es konnten signifikante Expressionsunterschiede festgestellt werden (Abb. 6D). Wir verglichen außerdem die Verteilung der sieben Genexpressionen in verschiedenen Tumoren. Es wurde festgestellt, dass UBE2S in den meisten Tumorgeweben stark exprimiert wird, während MIA hauptsächlich in Tumorgeweben von Melanomen (SKCM) konzentriert ist (ergänzende Abbildung S6A). Die Mutationen der sieben Gene wurden in verschiedenen Tumoren weiter untersucht und es konnte festgestellt werden, dass die höchste Mutationsrate CHD5 war, gefolgt von E2F3. Und die Arten von Mutationen konzentrierten sich hauptsächlich auf Amplifikation, tiefe Deletion und Missense-Mutation (Abb. 6E).

Validierung und Untersuchung von Risikomodellen. (A) Die Fähigkeit klinischer Indikatoren und Risikoscores, die Prognose im Jahr 1, Jahr 3 und Jahr 5 zu bestimmen, wurde mithilfe von ROC-Kurven verglichen. (B) Die ROC-Kurve zeigt die Fähigkeit des Risikoscores, die Prognose im Jahr 1, Jahr 3 und Jahr 5 zu bestimmen. (C) Die Kaplan-Meier-Kurven zeigten die OS-Zeit der beiden Risikogruppen von Patienten im TARGET-Datensatz . (D) Die Heatmap zeigte die Expressionsniveaus von sieben Risikomodellgenen bei Patienten. (E) Mutationen von 7 Risikomodellgenen in mehreren Tumoren. (F) Vergleich der Unterschiede in den SCHÄTZUNGSergebnissen zwischen Hoch- und Niedrigrisikogruppen. Rote Punkte zeigten an, dass Patienten zu Cluster 1 gehören, und grüne Punkte zeigten an, dass Patienten zu Cluster 2 gehören. (G) Boxplots zeigten die mRNA-Expression von Immun-Checkpoints in zwei Risikogruppen (*P < 0,05; **P < 0,01; ** *P < 0,001). (H) Boxplot der Verteilung der Immunzellexpression zwischen den beiden Risikogruppen, berechnet durch den ssGSEA-Algorithmus (*P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001).

Die Ergebnisse des vorherigen ESTIMATE-Algorithmus wurden verwendet, um Gruppen basierend auf hohem und niedrigem Risiko zu vergleichen. Die Analyseergebnisse zeigen im GSE45547-Datensatz eine höhere Tumorreinheit in der Hochrisikogruppe als in der Niedrigrisikogruppe (P < 0,05). Relativ dazu waren Stromal Score, Immune Score und ESTIMATE Score in der Hochrisikogruppe niedriger als in der Niedrigrisikogruppe (P < 0,05) (Abb. 6F). In GSE49710, GSE73517, GSE120559 und E-MTAB-8248 wiesen Tumorreinheit, Immun-Score und ESTIMATE-Score die gleichen Unterschiede in der Hochrisikogruppe gegenüber der Niedrigrisikogruppe auf (ergänzende Abbildung S6B – E). Wir verglichen außerdem die Expression von Immun-Checkpoints zwischen Gruppen mit hohem und niedrigem Risiko (Abb. 6G). Kombiniert mit den Ergebnissen von ssGSEA kann der Schluss gezogen werden, dass die Gruppe mit geringem Risiko einen besseren Immunstatus hatte (Abb. 6H).

Die Verteilung der Risikoscores innerhalb des MYCN-Status, des Alters und der INSS-Stadien wurde bei 1670 Patienten aus allen 5 Microarray-Datensätzen weiter untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass Patienten mit MYCN-Amplifikationsstatus, Alter ≥ 18 Monate und fortschreitender Verschlechterung des INSS-Stadiums alle höhere Risikowerte aufwiesen (Abb. 7A). Patienten in E-MTAB-8248, GSE73517 und GSE120559 wurden basierend auf den optimalen Grenzwerten in zwei Gruppen eingeteilt, Hochrisiko- und Niedrigrisikogruppen. Wie in Tabelle 2 gezeigt, waren TERT-Umlagerungen in der Hochrisikogruppe häufiger (P < 0,05). Allerdings unterschied sich das positive Ergebnis der ALT-assoziierten Promyelozytenleukämiekörperchen statistisch nicht zwischen den beiden Gruppen (P > 0,05). Anschließend wurde der Zusammenhang zwischen Risikogruppierung und chromosomaler Instabilität weiter untersucht. Die Ergebnisse der Analyse bestätigten, dass sich die 1p-Deletion und der 17q-Gewinn in den Hoch- und Niedrigrisiko-Untergruppen unterschieden und dass die Hochrisikogruppe mit größerer Wahrscheinlichkeit diese Aberrationen aufwies (P < 0,05). Im Gegensatz dazu unterschied sich die 11q-Deletion statistisch nicht zwischen den beiden Gruppen (P < 0,05) (Abb. 7B).

Vergleich zwischen Hoch- und Niedrigrisikogruppen. (A) Vergleich der Risikoscores in MYCN-Status, Altersgruppen und INSS-Stadien. (B) Das Sankey-Diagramm zeigte die Verteilung der Chromosomenanomalien in den beiden Risikogruppen. (C) Die Wärmekarte zeigte die Niveaus unterschiedlicher Gene zwischen der Hoch- und Niedrigrisikogruppe. (D) TOP 10 Hub-Gene, identifiziert durch den MCC-Algorithmus. (E) Das Balkendiagramm zeigte die Ergebnisse der GSVA-Anreicherung. Lila stellte die wichtigsten angereicherten Signalwege in der Gruppe mit hohem Risiko dar, und Grün stellte die wichtigsten Signalwege in der Gruppe mit niedrigem Risiko dar. (F) Die TOP 3 der bedeutendsten GO-angereicherten Begriffe in der Hochrisiko- und Niedrigrisikogruppe. (G) Die TOP 3 der bedeutendsten KEGG-angereicherten Signalwege in der Hochrisiko- und Niedrigrisikogruppe.

Wir haben uns durch Varianzanalyse weiter mit den eng miteinander verbundenen Mechanismen der klinischen und Risikogruppierung befasst. Patienten mit 1670 Microarray-Daten wurden basierend auf dem Risikomodell zur Differenzanalyse weiter in Hoch- und Niedrigrisikogruppen eingeteilt. Insgesamt wurden 314 differenzielle Gene erhalten, darunter 146 herunterregulierte Gene und 168 hochregulierte Gene (Hochrisiko vs. Niedrigrisiko). Wie in der Heatmap gezeigt, konnten die Differenzgene gut zwischen Hoch- und Niedrigrisikogruppen unterscheiden (Abb. 7C). Das Vulkandiagramm zeigte die fünf besten Gene in den Differentialgenen, sortiert nach ihrem angepassten P-Wert (ergänzende Abbildung S7A). Anschließend haben wir mithilfe der STRING-Datenbank ein PPI-Netzwerk erstellt (Ergänzende Abbildung S7B, C). Die auf dem MCC-Algorithmus basierenden TOP 10-Gene wurden außerdem in herunterregulierten Genen und hochregulierten Genen nachgewiesen (Abb. 7D).

Die Anreicherungsanalyse unterschiedlicher Gene in der Hallmark-Datenbank mithilfe des GSVA-Algorithmus ergab signifikante Unterschiede zwischen den beiden Gruppen in zahlreichen Signalwegen (Abb. 7E). In der Hochrisikogruppe waren die signifikanten Signalwege MYC Targets_V2, MYC Targets_V1, E2F Targets, ungefaltete Proteinantwort, Mtorc1-Signalisierung, G2M-Chickpoint und DNA-Reparatur. In der Gruppe mit niedrigem Risiko waren apikale Oberfläche, UV-Reaktion_DN, apikaler Übergang, Komplement, HEME-Metabolismus und Myogenese die signifikanten Signalwege. Bei einer weiteren Analyse mithilfe der GSEA-Anreicherungsmethode konnten wir feststellen, dass die Wege von GO in der Hochrisikogruppe die Segregation von mitotischen Schwesterchromatiden, die Segregation von Kernchromosomen und die Segregation von Schwesterchromatiden waren. Die TOP-3-Begriffe der Gruppe mit geringem Risiko waren Antigenverarbeitung und -präsentation, Antigenverarbeitung und Präsentation von exogenem Antigen und Antigenverarbeitung und Präsentation von exogenem Peptidantigen (Abb. 7F). Die KEGG-Ergebnisse zeigten hingegen, dass die Hochrisikogruppe hauptsächlich eng mit den drei Signalwegen Zellzyklus, DNA-Replikation und Ribosom verbunden war (Abb. 7G). Die Signalwege in der Niedrigrisikogruppe konzentrierten sich auf immunbezogene Signalwege wie Amphetaminabhängigkeit, hämatopoetische Zelllinie und rheumatoide Arthritis. Basierend auf den Anreicherungsergebnissen könnte die schlechtere Prognose in der Hochrisikogruppe damit zusammenhängen.

Der Random-Forest-Algorithmus wurde verwendet, um die Gene des neuronalen Netzwerks auszuwählen. Wir haben sowohl die Mean Decrease Accuracy (MDA) als auch die Mean Decrease Gini (MDG) verwendet, um die 50 wichtigsten Gene zu ermitteln, und haben den Schnittpunkt der beiden als letzte Schlüsselgene genommen. Durch das Diagramm der Rate, des Fehlers gegenüber der Anzahl der Bäume haben wir mtry = 6, ntree = 1200 als letzten Parameter des Modells gewählt (ergänzende Abbildung 8A, B). In unserem endgültig angepassten Modell betrug der Out-of-Bag-Wert (OOB) 2,95 %. Wie in Abb. 8A gezeigt, wurden schließlich 37 Gene für die Konstruktion neuronaler Netzwerkmodelle für Neuroblastompatienten identifiziert. Experimentell betrug die Anzahl der verborgenen Schichten 1 mit insgesamt 20 verborgenen Neuronen und die Lernrate = 0,1 war die endgültige Einstellung des Modells (Abb. 8B). Die von uns gewählte Aktivierungsfunktion war „tanh“. Wir haben das Training mit 643 Patienten aus dem GSE45547-Datensatz abgeschlossen und eine externe Validierung bei 493 Patienten aus GSE49710 mit guten Ergebnissen (AUC = 0,966) durchgeführt (Abb. 8C).

Neuronale Netze und Behandlungsanalyse. (A) Wichtigkeitsranking-Diagramm der Variablen basierend auf MDA und MDG. (B) Schematische Darstellung der neuronalen Netzwerkstruktur. Die äußere rote Schicht stellt die Eingabeschicht dar, die mittlere blaue Schicht stellt die 20 verborgenen Neuronen dar und die Ausgabeschicht ist gelb. (C) ROC-Kurven zeigen die Klassifizierungsleistung des neuronalen Netzwerks im GSE49710-Datensatz. (D) Bewertung der Überlebenswahrscheinlichkeit des Patienten mithilfe von Nomogrammen. (E) Zielgenexpressionsniveaus der Immuntherapie. (F) G1/S-Zellzyklus-Checkpoint-Genexpressionsniveaus. (G) G2/M-Zellzyklus-Checkpoint-Genexpressionsniveaus. (H) Ergebnisse der Arzneimittelsensitivitätsanalyse der GDSC-Datenbank. (I) Wärmekarte der Korrelation zwischen Risikobewertung und Arzneimittelsensitivität.

Wir haben weiter untersucht, ob diese beiden Indikatoren mit dem Überleben zusammenhängen. Die Cluster-Gruppierung und der Risiko-Score wurden in die univariate Cox-Regressionsanalyse einbezogen, die ergab, dass sowohl Cluster 1 als auch der höhere Risiko-Score Risikofaktoren waren, die die Prognose beeinflussten (Tabelle 3). Klinische Indikatoren wie das Alter, ob MYCN verstärkt wurde und das INSS-Stadium wurden außerdem in die multifaktorielle Regressionsanalyse einbezogen und die Ergebnisse zeigten, dass nur der Risikoscore und das Alter ein unabhängiger Risikofaktor für die Prognose waren (ergänzende Abbildung 8C). Um die Beurteilung der Prognose zu erleichtern, wurden Nomogramme nach Alter und Risikoscore erstellt. Die Überlebenswahrscheinlichkeit nach 1, 3 und 5 Jahren wurde durch Berechnung der Anzahl der Punkte vorhergesagt (Abb. 8D).

Wir haben außerdem die Bedeutung von Clustering und Risikobewertung als Leitfaden für die Behandlung untersucht. Da die Immuntherapie eine Behandlungsmethode mit großem Potenzial darstellt, haben wir die Verteilung potenziell verwendeter Ziele in der Immuntherapie zwischen den beiden geclusterten Untergruppen verglichen. Wir konnten in Cluster 1 und Cluster 2 unterschiedliche Expressionsniveaus von Immuntherapiezielen finden, was darauf hindeutet, dass unterschiedliche Cluster, die unterschiedliche Immuntherapien verwenden, möglicherweise prognostischer sind (Abb. 8E). Eine gezielte Zellzyklustherapie ist ebenfalls eine wichtige Behandlungsmethode. Es war interessant festzustellen, dass die Zellzyklus-Kontrollpunkte zwischen den beiden Gruppen signifikant unterschiedlich waren (Abb. 8F, G). Die Expression von CDK2, CDK4 und CDK6 war in Cluster 1 höher als in Cluster 2, während die Expression von ATM in Cluster 2 höher war als in Cluster 1. Wir haben auch die Korrelation mit dem IC50 des onkologischen Arzneimittels in der GDSC-Datenbank von GSCA analysiert unter Verwendung der Gene, die für das neuronale Netzwerk verwendet wurden (Abb. 8H). Basierend auf den Ergebnissen der Analyse glauben wir, dass Cluster 2 für die vier Medikamente RDEA119, Selumetinib, Trametinib und PD-0325901 besser geeignet sein könnte. Daten aus der CellMiner-Datenbank der NCI-60-Zelllinien wurden heruntergeladen und Sensitivitätsanalysen zwischen Risikobewertungen und Arzneimitteln durchgeführt, die klinische Studien durchlaufen hatten und von der FDA zugelassen wurden. Wir haben P <0,01 als unseren Filterindex festgelegt und die Ergebnisse mit einer Heatmap angezeigt (Abb. 8I). Basierend auf den Ergebnissen der Analyse konnte festgestellt werden, dass die meisten Medikamente negativ mit den Risikoscores korrelierten.

Da es sich um einen sehr heterogenen soliden Tumor handelt, ist eine individualisierte Behandlung des Neuroblastoms zur Verbesserung seiner Prognose in diesem Stadium ein Problem. Derzeit basiert das Neuroblastom hauptsächlich auf dem INRG-Risikostratifizierungssystem, um die Behandlung verschiedener Patienten zu steuern22. Dennoch beträgt das 5-Jahres-EFS für Kinder mit metastasiertem Neuroblastom und im Alter von 18 Monaten oder älter nur nahezu 50 %23. Da zellzyklusspezifische Inhibitoren untersucht werden und zellzyklusbezogene Mechanismen bei Neuroblastompatienten immer mehr an Bedeutung gewinnen, ist die Verwendung zellzyklusbezogener Gene wichtig, um molekulare Subtypen zu identifizieren und therapeutische Ziele oder prognostische Biomarker bei Neuroblastompatienten zu finden.

Wir haben zunächst die Machbarkeit der Typisierung von Patienten anhand ihrer Gene demonstriert, indem wir 643 Proben mithilfe des tSNE-Algorithmus basierend auf den Genexpressionsniveaus herunterskaliert haben. Angesichts der vielversprechenden Anwendung der Immuntherapie identifizierten wir in unserer Studie zunächst 924 immunbezogene Zellzyklusgene mithilfe des WGCNA-Algorithmus. Diese Gene korrelierten negativ mit dem ESTIMATE-Score und positiv mit der Tumorreinheit. Basierend auf den oben genannten Genen haben wir die 1811 Patienten in zwei Cluster mit deutlichen Unterschieden eingeteilt.

Hinsichtlich der klinischen Informationen weisen die beiden Cluster ihre eigenen signifikanten Merkmale auf. Insgesamt tendierten die klinischen Indikatoren in Cluster 1 alle stärker zu einer ungünstigen Prognose im Vergleich zu Cluster 2. Der Anteil der Patienten in Cluster 2 mit einem Alter < 18 Monaten war viel höher als in Cluster 1 (P < 0,05). Für die Verteilung des MYCN-Status in den beiden Gruppen kann Cluster 1 als MYCN-amplifizierte Gruppe und Cluster 2 als MYCN-nicht-amplifizierte Gruppe betrachtet werden. Obwohl 29 von 940 Patienten in Cluster 2 den MYCN-Amplified-Status aufwiesen, verdeutlicht dies indirekt die Einschränkung der Verwendung einer einzigen Klassifizierung biologischer Indikatoren in klinischen Situationen. Beim häufig verwendeten INSS-Staging machte Stadium 4 in Cluster 1 60 % der Gesamteinstufung aus, während dieser Anteil in Cluster 2 nur etwa 22 % betrug. Die Studie zeigte, dass der MYCN-Status und das INSS-Stadium umso höher waren, je älter das Kind diagnostiziert wurde (18 Monate als Cut-off-Wert), was alles drei Anzeichen für eine ungünstige Prognose waren22,24. Cluster 1 zeigte auch eine stärkere chromosomale Instabilität, was durch die Tatsache gezeigt wird, dass Patienten mit 1p-Deletion und 11q-Deletion stärker in Cluster 1 konzentriert waren (P < 0,05). Das Phänomen der TERT-Umlagerung war in Cluster 1 ebenfalls häufiger (P < 0,05). Es gab jedoch keinen Unterschied in der Verteilung von 17q-Gain- und ALT-assoziierten Promyelozyten-Leukämiekörpern in den beiden Clustern (P > 0,05). Die durch die Überlebensanalyse aufgezeichneten Kaplan-Meier-Kurven bestätigten auch, dass die OS-Zeit von Cluster 2 besser war als die von Cluster 1. Wir untersuchten die Immuninfiltration zwischen den beiden Clustern weiter. Wir haben in jedem der sechs Datensätze eine Immunbewertung mithilfe der drei Algorithmen CIBERSORT, ssGSEA und ESTIMATE durchgeführt. Wenn wir die Ergebnisse kombinieren, können wir davon ausgehen, dass Cluster 2 einen besseren Immunstatus hat. Dies könnte auch teilweise erklären, warum Cluster 2 eine bessere Prognose hat.

Immun-Checkpoints als Grundlage für die Immuntherapie: Wir haben die Expression von 24 Immun-Checkpoints zwischen zwei Clustern bewertet. Wir fanden heraus, dass LAG3, CD276 und CD86 in Cluster 1 stark exprimiert wurden, während die meisten Immun-Checkpoints in Cluster 2 stark exprimiert wurden. Dies war untrennbar mit den Merkmalen der Krankheit verbunden. Die MYCN-Amplifikation korrelierte mit einer höheren Anzahl von LAG3 + Typ 1 regulatorischen (Tr1) Zellen im peripheren Blut25. CD276(B7-H3) wird in Tumoren stark exprimiert und in normalen Geweben nur eingeschränkt exprimiert, was ein potenzielles therapeutisches Ziel darstellt26. Im Experiment konnten chimäre Antigenrezeptor-T-Zellen gegen CD276 die Heterogenität des Neuroblastoms überwinden27. Die hohe Expression von CD86 könnte mit einer höheren Tumorreinheit in Cluster 1 verbunden sein. Untersuchungen zeigen, dass CD86 in vitro eine T-Zell-Immunantwort bei Neuroblastomen induzierte und als wirksamer Tumorimpfstoff im Tumorpräventionsmodell diente28.

Die Ergebnisse der Anreicherungsanalyse unterschiedlicher Gene zwischen den beiden Clustern zeigten außerdem die Unterschiede in den Signalwegmechanismen zwischen den beiden Clustern. Die stark exprimierten Gene in Cluster 1 konzentrierten sich auf zellzyklusbezogene Pfade, die Chromosomensegregation, Mikrotubuli-Bindung und Chromosomenregion umfassen. Die Analyse der bisherigen klinischen Informationen ergab außerdem, dass Cluster 1 eine stärkere chromosomale Instabilität aufwies. Ebenso weist Cluster 2 einen besseren Immunstatus auf, wie aus den Anreicherungsergebnissen hervorgeht. Es gibt Hinweise darauf, dass tumorspezifisches MHC-II mit einer guten Prognose für Krebspatienten verbunden ist, einschließlich derjenigen, die mit einer Immuntherapie behandelt werden29.

Um die individuelle Situation jedes Patienten besser einschätzen zu können, haben wir versucht, ein Risikomodell unter Verwendung von DEGs zwischen den beiden Clustern zu erstellen. Weitere Analysen zeigten, dass es eine bessere Vorhersagekraft als herkömmliche Biomarker hatte. Wir haben zunächst mithilfe des Cox-Modell-Screenings 177 Gene von DEGs erhalten, die eng mit dem Überleben verbunden waren (P <0,01). Random Survival Forest (RSF), ein maschinell lernender Überlebensalgorithmus, hat viele Anwendungen in der Biomedizin30,31. In dieser Studie wurden die von RSF berechneten VIMP-Werte jedes Gens verwendet, um weiter nach Genen zu suchen, die eng mit dem Überleben zusammenhängen. Die 50 Gene mit den größten VIMP-Werten wurden in das Lasso-Cox-Regressionsmodell einbezogen. Schließlich wurden 7 Gene (NMU, E2F3, UBE2S, DHFR, MIA, CHD5, FAXDC2) für die Konstruktion des Modells erhalten. Unter diesen gehören NMU, E2F3, UBE2S und DHFR zu Cluster 1 im Vergleich zu Cluster 2 stark exprimierter Gene. Während MIA, CHD5 und FAXDC2 Gene mit geringer Expression waren.

Neuromedin U (NMU) verdankt seinen Namen seiner starken Kontraktionswirkung auf die Muskeln der Gebärmutter der Ratte32. Obwohl Neuronen angeborene Typ-2-Lymphozyten über Neuromedin U33 regulieren, ist eine hohe NMU-Expression mit einer schlechten Krebsprognose verbunden34,35. Der E2F-Transkriptionsfaktor 3 (E2F3) interagiert direkt mit dem Retinoblastom-Protein, um die Expression von Genen zu regulieren, die am Zellzyklus beteiligt sind. Harold I. Saavedra et al. fanden in mehreren Studien heraus, dass eine Überexpression von E2F3 eine Zentrosomenamplifikation und unkontrollierte Mitose verursacht, was eine chromosomale Instabilität fördern kann, die zu Tumoren führt36,37. Es wurde gezeigt, dass das Ubiquitin-konjugierende Enzym E2 S (UBE2S) die Entwicklung von Eierstockkrebs fördert, indem es den PI3K/AKT/mTOR-Signalweg zur Regulierung des Zellzyklus fördert38. Unterdessen kann UBE2S mit TRIM28 im Zellkern zusammenarbeiten, um den Zellzyklus durch Ubiquitinierung von p27 zu beschleunigen und so ein hepatozelluläres Karzinom zu entwickeln39. In den letzten Jahren wurde Dihydrofolatreduktase (DHFR), ein Schlüsselenzym im Ein-Kohlenstoff-Stoffwechsel, als Ziel für die Krebstherapie erkannt40,41. Ein positiver Koeffizient für die vier oben genannten Gene im Risikomodell bedeutet, dass der Patient umso gefährdeter ist, je höher die Genexpression ist.

MIA kann die Trennung von Zellen von der extrazellulären Matrix fördern42. Das Chromodomänen-Helicase-DNA-Bindungsprotein 5 (CHD5) hat seine einzigartige Rolle als neuartiger Tumorsuppressor bei einer Vielzahl von Krebsarten unter Beweis gestellt43,44,45. Die Fettsäure-Hydroxylase-Domäne mit 2 (FAXDC2), ein Mitglied der Fettsäure-Hydroxylase-Superfamilie, ist ein Neo-Gen, das die Megakaryozyten-Reifung fördert, was darauf hindeutet, dass es einen potenziellen Wert als Differenzierungstherapie haben könnte46. Zusammengenommen umfassen die sieben Risikomodellgene sowohl diejenigen, die intensiv untersucht wurden, als auch diejenigen, die noch nicht erforscht sind, was auf den potenziell breiten Forschungswert von Risikomodellgenen bei Neuroblastomen schließen lässt. Gleichzeitig zeigte die ROC-Kurvenanalyse, dass die AUC-Werte der OS-Signatur in 1, 3 und 5 Jahren 0,9527, 0,87266 und 0,8792 betrugen, was darauf hindeutet, dass unsere Prognosesignaturen eine günstige Unterscheidung aufweisen. Darüber hinaus zeigte das Risikomodell im Vergleich zu anderen einzelnen klinisch-biologischen Indikatoren eine bessere Vorhersagekraft.

Eine gruppenübergreifende Analyse der beiden Gruppen, die auf der Grundlage von Risikobewertungen gruppiert wurden, ergab deutliche Unterschiede im Immunniveau und in den klinischen Informationen zwischen den beiden Gruppen. Wir konnten feststellen, dass LAG3, CD276 und CD86 in der Hochrisikogruppe stark exprimiert waren. Durch die Kombination mehrerer Immunisierungsalgorithmen könnten wir davon ausgehen, dass die Gruppe mit geringem Risiko einen besseren Immunstatus hat. Ergebnisse der klinischen Analyse zeigten, dass Patienten mit MYCN-Amplifikationsstatus, Alter ≥ 18 Monate und fortschreitender Verschlechterung des INSS-Stadiums alle höhere Risikowerte aufwiesen, was die Übereinstimmung des Risikomodells mit dem klinischen zeigte. Die Ergebnisse der GSEA-Anreicherung in der Hochrisikogruppe zeigten eine starke Korrelation mit dem MYC-Signalweg. MYC-Gene sind eine Klasse von Nukleoprotein-Onkogenen, und als breit wirkender Transkriptionsfaktor reguliert MYC die Zelldifferenzierung und -proliferation durch eine Vielzahl von Mechanismen, einschließlich der Transkriptionsamplifikation von Zielgenen47,48. Darüber hinaus ist die Hochrisikogruppe eng mit Signalwegen wie dem Zellzyklus und der Chromosomensegregation verbunden. Anomalien in diesen Signalwegen können dazu führen, dass Patienten eine schlechte Prognose haben. Im Gegensatz dazu zeigte die Gruppe mit niedrigem Risiko eine starke Korrelation mit der Immunität, was zusammen mit den Ergebnissen der Immunanalyse den besseren Immunstatus der Gruppe mit niedrigem Risiko bestätigte.

Zwei molekulare Subtypen von Neuroblastomen haben Patienten erfolgreich klassifiziert, und ein Risikomodell, das auf der Analyse von Unterschieden zwischen Subtypen basiert, konnte den Überlebensstatus von Patienten quantitativ besser bewerten. In diesem Stadium sind neuronale Netzwerkmodelle zu einem leistungsstarken Werkzeug für maschinelles Lernen geworden. Um die Ergebnisse der Studie besser in der Klinik anwenden zu können, haben wir die Ergebnisse der Inter-Cluster-Varianzanalyse verwendet, um einen neuronalen Netzwerkklassifikator zu erstellen, der auf Neuroblastompatienten anwendbar ist. Ein neuronales Netzwerk basierend auf 37 Genen, das bei 643 Patienten aufgebaut wurde, wurde bei der Klassifizierung von 493 Patienten gut validiert (AUC = 0,966).

Das Ziel molekularer Subtypen und Risikomodelle besteht darin, Patienten bei der Entwicklung individueller Behandlungspläne zu unterstützen und die Prognose zu verbessern. Diese Studie liefert die Ergebnisse von Sensitivitätsanalysen für mehrere Arzneimitteldaten. Die auf den Zellzyklus ausgerichtete Therapie ist ein vielversprechendes therapeutisches Instrument49. Mit dem klinischen Erfolg von CDK4/6-Inhibitoren könnte die gezielte Behandlung einzelner Zellzykluskomponenten zu einer wirksamen Antikrebsstrategie werden50. Die Verteilung der Zellzyklus-Kontrollpunkte zwischen den beiden Clustern wies ihre eigenen signifikanten Merkmale auf. Für Cluster 1 mit höheren Expressionsniveaus von CDK4, CDK6 und PLK1 können wir die Behandlung durch die Anwendung von Zellzyklusbremsen durchführen. Zu den Arzneimitteln in diesem Segment gehören Palbociclib, Ribociclib und Abemaciclib, die auf CD4/651 abzielen, sowie BI 253652 und GSK46136453, die auf PLK1 abzielen. Im Gegensatz dazu war ATM in Cluster 2 stark ausgeprägt. Patienten können mit M3541 und AZD0156 behandelt werden, indem der Zellzyklus beschleunigt wird15.

Unter diesen hat die Immuntherapie ein großes Potenzial zur Krebsbekämpfung, und die Immuntherapie bei Neuroblastomen wird nach und nach eingehend untersucht. GD2 ist das häufigste Zielantigen für die Neuroblastom-Immuntherapie54,55. Obwohl sich B4GALNT1, das Enzym, das den letzten Schritt der GD2-Synthese katalysiert, zwischen den beiden Clustern ST3GAL5 und ST8SIA1 nicht unterschied, wurden Gene, die weiter oben im Syntheseweg liegen, in Cluster 1 stärker exprimiert als in Cluster 2. Dies wurde gezeigt dass eine Herunterregulierung von ST8SIA1 den Verlust von GD2 fördert, was zu einem Engpass bei der Synthese und Expression von GD2 führt, was zum Versagen von Anti-GD2-Antikörpern führt56. Die Ergebnisse von Studien zu B7-H3 (CD276), ALK, GPC2 und PHOX2B als neuartige immuntherapeutische Ziele sind vielversprechend für die Behandlung von Neuroblastomen57,58. In dieser Studie ergab ein Vergleich der Expression dieser Ziele eine höhere Expression in Cluster 1.

Die Heterogenität des Neuroblastoms zeigt sich auf verschiedene Weise und wir hoffen, verschiedene Patientenkategorien klassifizieren und das Risikoprofil der Patienten auf genetischer Ebene beurteilen zu können. Basierend auf den Ergebnissen der Studie wird dem Patienten weiterhin ein rationaler individueller Behandlungsplan zugewiesen. Eine individuelle Behandlung verbessert die Prognose des Patienten, nutzt die medizinischen Ressourcen optimal aus und verringert die finanzielle Belastung des Patienten. Obwohl unsere molekularen Subtyp- und Risikomodelle bei der Beurteilung der klinischen Leistung, des Immunstatus und der Überlebensprognose gut abschnitten, sollten in dieser Studie bestimmte Einschränkungen beachtet werden. Alle unsere Ergebnisse wurden durch die Analyse von Patienteninformationen und Genexpressionsprofilen in öffentlichen Datenbanken ermittelt, die durch die Daten beeinflusst werden können, was zu verzerrten Ergebnissen führen kann. Dieses Manko konnten wir jedoch dadurch kompensieren, dass wir möglichst viele Patienten einsammelten.

Wir haben ein neuronales Netzwerkmodell zur Klassifizierung von Neuroblastompatienten und ein Risikomodell zur Beurteilung des prognostischen Status von Patienten entwickelt. Die in der Studie aufgedeckten mechanistischen Unterschiede zwischen den Gruppen sind für unser Verständnis des Neuroblastoms von größerem Nutzen. Gleichzeitig werden die molekularen Subtypen und das Risikomodell verwendet, um Ärzten bei der Auswahl der besten Behandlungsstrategie zu helfen. Die in dieser Studie gewonnenen 37 Subtyp-Klassifizierungsgene und 7 Risikomodell-Gene liefern neue Ideen für weitere Experimente.

Der Satz von Genen der zellzyklusbezogenen Signalwege in GO und KEGG und -wegen wurde über die Molecular Signatures Database59 (https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/index.jsp) heruntergeladen und zusammengestellt, um 1865 zu erhalten Zellzyklus-bezogene Gene für weitere Studien. Gemeinsame Immun-Checkpoint- und Zellzyklus-Checkpoint-Namen wurden durch Literaturlesen gesammelt und übersetzt, um sie mit den Gennamen in der Expressionsmatrix abzugleichen. Daten zu den Expressionsniveaus von Zielgenen bei mehreren Krebsarten wurden von der Gene Expression Profiling Interactive Analysis-Plattform60 (GEPIA, http://gepia.cancer-pku.cn/) erhalten. Erforschung und Visualisierung von Mutationen in Zielgenen von mehrdimensionalem Krebs durch das cBioPortal for Cancer Genomics61 (http://www.cbioportal.org).

Es wurde eine systematische Suche nach öffentlich verfügbaren transkriptomischen Daten mit klinischen Anmerkungen zum Neuroblastom durchgeführt. Insgesamt wurden fünf Microarray-Datensätze mit klinischen Informationen und ein RNA-Sequenzierungsdatensatz (RNA-seq) mit dem Namen TARGET-NBL, der von Genomic Data Commons (https://gdc.cancer.gov/) heruntergeladen wurde, in unsere Studie einbezogen. Microarray-Genexpressionsdaten, die GSE4554762, GSE49710, GSE7351763 und GSE12055964 enthielten, wurden von Gene Expression Omnibus (GEO, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) heruntergeladen und E-MTAB-824865 wurde von ArrayExpress heruntergeladen ( https://www.ebi.ac.uk/biostudies/arrayexpress). Für die heruntergeladenen Microarray-Daten wurden die Daten normalisiert. Für den TARGET-Datensatz wurden sowohl der FPKM-Wert der Genexpression als auch der Zählwert heruntergeladen. In allen Datensätzen wurden Patienten ohne MYCN-Status entfernt. Wir verwendeten den t-distributed stochastic neighbour embedding (t-SNE)-Algorithmus, um die mehrdimensionalen Expressionsdaten von Patienten zur Beobachtung der Tumorheterogenität herunterzuskalieren. Für die anschließende Integration des Datensatzes haben wir die ComBat-Methode in der R-Sprache mit „sva“ package66 (Version 3.44.0) übernommen, um den Batch-Effekt zwischen den Datensätzen zu beseitigen. Die Hauptkomponentenanalyse wurde verwendet, um zu bewerten, ob der Batch-Effekt entfernt wurde.

In die Analyse einbezogen wurden die zellzyklusbezogenen Gene, die aus der vorherigen Sammlung gewonnen wurden. Die gewichtete Gen-Koexpressionsnetzwerkanalyse (WGCNA)67 wurde mit dem „WGCNA“-Paket (Version 1.71) durchgeführt, um ein skalenfreies Koexpressionsnetzwerk aufzubauen und ein Genmodul zu identifizieren, das hauptsächlich mit ESTIMATE-Ergebnissen assoziiert war. Die Gene in diesem Modul wurden als Immune-Related Cell Cycle Genes (IRCCGs) identifiziert.

Wir haben das „ConsensusClusterPlus“-Paket68 (Version 1.60.0) in R verwendet und die Clusterbildung wurde auf der Grundlage der identifizierten immunbezogenen Zellzyklusgene ausgewählt. Die maximale Clusteranzahl wurde auf 5 festgelegt. Die endgültige Clusteranzahl wurde durch die Konsensmatrix und den Cluster-Konsens-Score (> 0,8) bestimmt. Die höheren Cluster-Konsenswerte weisen auf eine robustere Clusterbildung hin.

Die Tumorreinheit der Proben, StromalScore, ImmuneScore und ESTIMATEScore wurden mithilfe des R-Pakets „estimate“69 (Version 1.0.13) geschätzt. CIBERSORT70 wurde verwendet, um die relative Häufigkeit von 22 Immunzellarten in der Probe zu quantifizieren. Der Single-Sample Gene Set Enrichment Analysis (ssGSEA)-Algorithmus wurde verwendet, um die Häufigkeit von 28 Immunzelltypen in verschiedenen Proben zu quantifizieren.

Die Patienten wurden entsprechend dem Ergebnis der Clusteranalyse oder dem Ergebnis des Risikoscores in verschiedene Gruppen eingeteilt. DEGs von Microarray-Datensätzen wurden zwischen zwei Gruppen mithilfe des „limma“-Pakets71 (Version 3.52.2) untersucht. DEGs von Sequenzierungsdatensätzen wurden zwischen zwei Gruppen mithilfe des R-Pakets „DESeq2“ (Version 1.36.0) untersucht. Der DEG-Grenzwert wurde auf |log2 (Fold Change) |> 1 und der angepasste P-Wert < 0,05 festgelegt. Die Visualisierung der Ergebnisse der Varianzanalyse erfolgte in Form von Vulkandiagrammen und Heatmaps.

Die DEG-Funktionsanreicherungsanalyse, einschließlich der Analyse von Gene Ontology (GO)72 und Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)73, wurde mit dem R-Paket „clusterProfiler“74 (Version 4.4.4) durchgeführt. Ein angepasster P-Wert < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Das R-Paket „GSVA“ (Version 1.44.2) wurde verwendet, um eine Anreicherungsanalyse in der Hallmark-Datenbank durchzuführen, und der Grenzwert wurde auf 10 festgelegt. Für die GSEA-Anreicherungsergebnisse haben wir die Screening-Metriken als |Normalized Enrichment Score (NES) festgelegt )|> 1, NOM P-Wert < 0,05 und FDR (angepasster P-Wert) < 0,05.

Das PPI-Netzwerk wurde automatisch vom Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins (Version 11.5; https://string-db.org/) durchgeführt. Zur Visualisierung wurde die Software Cytoscape (Version 3.9.1) verwendet. Darüber hinaus wurde das CytoHubba-Plug-in verwendet, um wichtige Gene in diesem Netzwerk als Hub-Gene zu identifizieren. Wir verwendeten Maximal Clique Centrality (MCC)-Algorithmen, um die 30 wichtigsten Hub-Gene zu berechnen.

Zunächst führten wir eine Einzelfaktoranalyse nach dem Proportional-Hazards-Modell im E-MTAB-8248-Datensatz durch und verwendeten dabei die Ergebnisse der Inter-Cluster-Varianzanalyse. Die Analyse wurde durch „Survival“-R-Pakete (Version 3.3.1) erreicht und Gene mit P < 0,01 wurden als prognoserelevante Gene gescreent. Als nächstes verwendeten wir das Random Survival Forest (RSF)-Modell aus dem R-Paket „randomForestSRC“ (Version 3.1.1), um Kandidatengene, die eng mit dem Überleben zusammenhängen, weiter zu filtern. Der Algorithmus ordnete jedes Gen nach Wichtigkeit ein und wir wählten die 50 wichtigsten Gene aus, die in die anschließende Analyse einbezogen werden sollten. Mit dem R-Paket „glmnet“ (Version 4.1-4) wurden diese 50 Gene als Eingabe für das Cox-Regressionsmodell mit dem kleinsten absoluten Schrumpfungs- und Selektionsoperator (LASSO) und letztendlich zum Aussortieren der signifikanten Gene verwendet. In unserer Analyse haben wir schließlich 7 Gene für die Konstruktion des Risikoscore-Modells erhalten. Basierend auf den Expressionswerten der entsprechenden Gene der Patienten und den Cox-Koeffizienten können wir den Risikoscore für jeden Patienten gemäß dem Algorithmus des inneren Produkts von Matrizen berechnen. Die Berechnung wurde wie folgt öffentlich bekannt gegeben:

Der Random-Forest-Algorithmus aus dem R-Paket „randomForest“ (Version 4.7-1.1) wurde angewendet, um nach den wichtigsten Kandidatengenen zu suchen, die mit verschiedenen Clustern im GSE45547-Datensatz korrelieren. Basierend auf den Ergebnissen der Rangfolge der Bedeutung von Genen haben wir die sich überschneidenden Gene in den Top-50-Genen sowohl der Mean Decrease Accuracy (MDA) als auch der Mean Decrease Gini (MDG) als Eingabegene für den Aufbau des neuronalen Netzwerks ausgewählt. Das R-Paket „neuralnet“ (Version: 1.44.2) wurde verwendet, um ein Deep-Learning-Modell der Kandidatengene zu entwickeln, nachdem die Expressionswerte der Gene auf die maximalen und niedrigsten Werte standardisiert wurden. Wir legen versteckte Schichten und 20 versteckte Neuronen im GSE45547-Datensatz fest, um das Modell zu trainieren. Für unser konstruiertes neuronales Netzwerkmodell in GSE49710 zur externen Validierung.

Die Analyse der Korrelation zwischen Gensätzen und Medikamenten wurde aus einer Analyse mit der Online-Site GSCA75 (http://bioinfo.life.hust.edu.cn/GSCA/#/) gewonnen. Diese Analyseplattform integriert Daten zur Arzneimittelsensitivität und Genexpression aus der GDSC-Datenbank. CellMiner (https://discover.nci.nih.gov/cellminer/home.do) ist eine Datenbank, die für die Krebsforschungsgemeinschaft entwickelt wurde, um die Integration und Untersuchung molekularer und pharmakologischer Daten für die NCI-60-Krebszelllinien zu erleichtern. Wir haben Daten über die NCI-60-Arzneimittelstudien heruntergeladen und sie auf die Aufnahme in unsere Studie auf Arzneimittel geprüft, die klinische Studien durchlaufen und von der FDA zugelassen wurden. Nach der Zusammenstellung der Daten verwendeten wir eine Korrelationsanalyse, um den Zusammenhang zwischen Risikobewertungen und Arzneimittelsensitivität zu bewerten.

Die Kaplan-Meier-Methode wurde verwendet, um Überlebenskurven mit dem Paket „survminer“ (Version 0.4.9) zu zeichnen. Zur Identifizierung prognostischer Faktoren wurde eine Einzelfaktoranalyse mittels Proportional-Hazards-Modell verwendet. Zur Identifizierung unabhängiger Prognosefaktoren wurde eine Multifaktoranalyse mittels Proportional-Hazards-Modell verwendet. Mithilfe des „rms“-Pakets (Version 6.3-0) wurde ein prognostisches Nomogramm erstellt, das alle unabhängigen Prognosefaktoren umfasst, um das OS von Neuroblastompatienten vorherzusagen.

Die gesamte Datenverarbeitung und -analyse wurde in der R-Software (Version 4.2.1) von RStudio durchgeführt. Um zwei Gruppen kontinuierlicher Variablen zu vergleichen, verwendeten wir unabhängige Student-t-Tests zur Berechnung der statistischen Signifikanz, und Unterschiede zwischen nicht normalverteilten Variablen wurden mithilfe des Wilcoxon-Rangsummentests berechnet. Wir haben den Chi-Quadrat-Test oder den exakten Fisher-Test verwendet, um die statistische Signifikanz zwischen den beiden Sätzen kategorialer Variablen zu analysieren. Alle statistischen P-Werte waren zweiseitig und P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Die Studie basierte auf Open-Source-Daten aus mehreren Datenbanken. Für die in diese Datenbanken einbezogenen Patienten wurde eine ethische Genehmigung erteilt. Daher gibt es bei diesem Artikel keine ethischen Bedenken.

Die in dieser Studie verwendeten genetischen und klinischen Daten sind im GEO verfügbar (GSE45547: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE45547; GSE49710: https://www .ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE49710; GSE73517: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE73517; GSE120559 : https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE120559), GDC (https://xenabrowser.net/datapages/?cohort=GDC%20TARGET-NBL&removeHub=https %3A%2F%2Fxena.treehouse.gi.ucsc.edu%3A443) und ArrayExpress (https://www.ebi.ac.uk/biostudies/arrayexpress/studies/E-MTAB-8248?query=E-MTAB- 8248) Datenbanken. Zellzyklusbezogene Gene wurden aus der MSigDB (KEGG: https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/human/geneset/KEGG_CELL_CYCLE.html; GOBP: https://www.gsea-msigdb.org) erhalten /gsea/msigdb/human/geneset/GOBP_CELL_CYCLE.html). Daten zu den Expressionsniveaus von 7 Risikomodellgenen bei mehreren Krebsarten wurden von der GEPIA-Plattform (http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php?clicktag=matrix) erhalten. Mutationen in 7 Risikomodellgenen für mehrdimensionalen Krebs durch das cBioPortal for Cancer Genomics (https://www.cbioportal.org/results/oncoprint?cancer_study_list=laml_tcga_pan_can_atlas_2018%2Cacc_tcga_pan_can_atlas_2018%2Cblca_tcga_pan_can_atlas_2018%2Clgg_tcga_pan_ can_atlas_2018%2Cbrca_tcga_pan_can_atlas_2018%2Ccesc_tcga_pan_can_atlas_2018%2Cchol_tcga_pan_can_atlas_2018%2Ccoadread_tcga_pan_can_atlas_2018%2Cdlbc_tcga_pan_can_atlas_2018% 2Cesca_tcga_pan_can_atlas_2018%2Cgbm_tcga_pan_can_atlas_2018%2Chnsc_tcga_pan_can_atlas_2018%2Ckich_tcga_pan_can_atlas_2018%2Ckirc_tcga_pan_can_atlas_2018%2Ckirp_tcga_pan_can_atlas 2018 atlas_2018%2Cpcpg_tcga_pan_can_atlas_2018%2Cprad_tcga_pan_can_atlas_2018%2Csarc_tcga_pan_can_atlas_2018%2Cskcm_tcga_pan_can_atlas_2018%2Cstad_tcga_pan_can_atlas_2018%2Ctgct_tcga_ pan_can_atlas_2018%2Cthym_tcga_pan_can_atlas_2018%2Cthca_tcga_pan_can_atlas_2018%2Cucs_tcga_pan_can_atlas_2018%2Cucec_tcga_pan_can_atlas_2018%2Cuvm_tcga_pan_can_atlas_2018&Z_SCORE_TH RESHOLD=2.0&RPPA_SCORE_THRESHOLD=2.0 &profileFilter=mutations%2Cstructural_variants%2Cgistic&case_set_id=w_mut&gene_list=NMU%252C%2520E2F3%252C%2520UBE2S%252C%2520DHFR%252C%2520MIA%252C%2520CHD5%252C%2520FAXDC2&geneset_list=% 20&tab_index=tab_visualize&Action=Senden). Die für die Arzneimittelanalyse verwendeten Daten wurden von GSCA (http://bioinfo.life.hust.edu.cn/GSCA/#/drug) und CellMiner (https://discover.nci.nih.gov/cellminer/loadDownload) bezogen .do)-Datenbanken. Alle weiteren Daten, die die Schlussfolgerungen dieser Studie stützen, sind im Artikel und seinen Zusatzdateien enthalten.

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Wir möchten den öffentlichen Datenbanken, darunter GEO, GDC, ArrayExpress, MSigDB, GEPIA, cBioPortal, GSCA und CellMiner, für ihre Beiträge zur Humanmedizin danken, in denen sie riesige Datenmengen teilen. Wir danken den Autoren des R-Pakets für ihren Beitrag zur Weiterentwicklung der Bioinformatik. Wir bedanken uns für die finanzielle Unterstützung durch das Tianjin Health Science and Technology Project (ZC20014).

Medizinische Universität Tianjin, Tianjin, China

Enyang He, Bowen Shi, Ziyu Liu, Kaili Chang, Hailan Zhao, Wei Zhao und Hualei Cui

Tianjin Kinderkrankenhaus, Tianjin, China

Hualei Cui

Graduiertenschule der Tianjin Medical University, Tianjin, China

Enyang He, Bowen Shi, Ziyu Liu und Kaili Chang

Medizinische Grundschule der Tianjin Medical University, Tianjin, China

Hailan Zhao & Wei Zhao

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Forschungsidee und -design: EH und HC Datenerfassung: EH, HZ und WZ Datenanalyse: EH, BS, ZL und KC Manuskripterstellung: EH, BS und ZL Begutachtung: EH und HC

Korrespondenz mit Hualei Cui.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

He, E., Shi, B., Liu, Z. et al. Identifizierung der molekularen Subtypen und Erstellung von Risikomodellen beim Neuroblastom. Sci Rep 13, 11790 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-35401-3

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Eingegangen: 23. Dezember 2022

Angenommen: 17. Mai 2023

Veröffentlicht: 21. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35401-3

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